ОБОГАЩЕННАЯ ТРОМБОЦИТАМИ ПЛАЗМА: новые способы применения и методы лечения

Широкое применение терапии обогащенной тромбоцитами плазмой сдерживается отсутствием четкого понимания механизма ее действия, а также стандартов получения и применения PRP-препаратов. Перед вами — обзор научной литературы, проливающий свет на эти аспекты. Он позволяет оценить богатство возможностей метода, открывающихся перед врачами, и в частности косметологами*.

П. Ивертс (P. Everts), отдел исследований и разработок, Gulf Coast Biologics, Форт-Майерс, США

К. Ониси (K. Onishi), отделение физиотерапии и реабилитации, медицинский центр Питтсбургского университета, Питтсбург, США

П. Джайярам (P. Jayaram), отделение физиотерапии и реабилитации, медицинский колледж Бейлор, Хьюстон, США

Ж. Ф. Лана (J. F. Lana), Институт изучения кости и хряща, Индайятуба, Сан-Паулу, Бразилия

К. Мотнер (K. Mautner), Центр спортивной медицины и первой помощи в спорте, университет Эмори, Атланта, США

Аутологичная обогащенная тромбоцитами плазма (platelet-rich plasma — PRP) представ­ляет собой обработанную жидкую фракцию аутологичной периферийной крови с кон­центрацией тромбоцитов выше исходной. Уже более 30 лет PRP-терапию используют по различным показаниям — в частности, значительный интерес вызывают возможности аутологичной PRP-терапии в восстанови­тельной медицине.

Однако ее эффект не всегда устойчив, к тому же новые открытия ставят под сомнение це­лесообразность применения стандартной PRP-терапии. Причиной может быть суще­ствование множества разных коммерческих систем получения PRP и PRP-подобных препа­ратов. Эти системы различаются объемом по­лучаемой PRP и протоколами приготовления, что приводит к различиям в свойствах и био­логическом составе готовой PRP. Кроме того, cвой вклад в неоднозначность клинических результатов вно­сит отсутствие единых стан­дартов протоколов получения PRP и достаточной информа­ции по составу применяемых препаратов.

Основная причина интереса к PRP заключается в наличии в ней тромбоцитарных фак­торов роста (platelet growth factors — PGF) и присущих им функциях (табл. 1).

таблица.jpg

ТАБЛ. 1. Некоторые факторы роста и тромбоцитарные цитокины и их клетки-источники, содержащиеся в обогащенной тромбоцитами плазме.

ПРИНЦИПИАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ КЛИНИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ТЕРАПИИ ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ ПЛАЗМОЙ

Научное обоснование PRP-те­рапии состоит в том, что инъ­екция концентрата тромбо­цитов в месте повреждения тканей может запустить про­цесс их восстановления за счет высвобождения множе­ства биологически активных факторов (факторов роста, цитокинов, лизосом) и адге­зивных белков, отвечающих за запуск процесса гемостаза, синтез соединительной ткани и реваскуляризацию.

В числе основных преиму­ществ PRP — безопасность и современные высокотехноло­гичные методы изготовления биопрепаратов, обусловлива­ющие широту их возможного применения. Что особенно важно, PRP — это аутологич­ный продукт без известных побочных эффектов, в отли­чие от широко распростра­ненных кортикостероидов, также используемых в проти­вовоспалительных целях.

Однако на данный момент нет четких предписаний относительно состава и рецептуры инъекци­онных препаратов PRP; разные препараты существенно различаются по содержанию тромбоцитов и лейкоцитов, примеси эритро­цитов, а также по концентрации PGF.

ПОНЯТИЕ О ДЕЙСТВУЮЩЕЙ ДОЗИРОВКЕ ТРОМБОЦИТОВ

Поскольку терапевтическое действие PRP основано на высвобождении множества различных факторов роста, участвующих в восстановлении и регенерации тканей, ра-зумно предположить, что при более высокой дозировке тромбоцитов выше и локальная концентрация высвобожденных тромбо­цитарных биоактивных факторов. Однако корреляцию между числом тромбоцитов, их концентрацией и концентрацией высво­божденных тромбоцитарных биоактивных факторов роста и компонентов не всегда можно контролировать ввиду выраженных различий в исходном количестве тромбоци­тов у разных пациентов.

Имеют место и различия в методах приго­товления PRP. Также ряд тромбоцитарных факторов роста, участвующих в процессах восстановления тканей, уже содержится в плазменной фракции PRP, так что повышение числа тромбоцитов не влияет на регенера­тивный потенциал этих факторов роста.

Исследования in vitro свидетельствуют, что высокая концентрация тромбоцитарных факторов роста в ряде случаев оказывает не­желательный эффект. Это может быть связа­но с ограниченным количеством рецепторов клеточной мембраны. Соответственно, если уровень тромбоцитарных факторов роста слишком высок для имеющегося количества рецепторов, эти факторы роста отрицатель­но влияют на функции клеток.

Однако у исследований in vitro есть недостат­ки. Ввиду особенностей архитектуры тканей и организации клеток в любом организме идет непрерывный процесс взаимодействия между многими видами клеток. При культивировании in vitro не соблюдаются условия гомеостаза, снабжения тканей кислородом, а также отсут­ствуют внезапные смены состояния окружаю­щей межклеточной среды, из-за чего результа­ты применения PRP in vitro сложно перенести на условия клинической практики. Данные о клиническом действии PRP в срав­нении с условиями in vitro противоречи­вы. Graziani и соавт. обнаружили, что in vitro максимальное воздействие на пролифера­цию остеобластов и фибробластов достига­ется при концентрации тромбоцитов в PRP в 2,5 раза выше исходной. Клинические же данные, представленные Park и соавт., указы­вают, что для обеспечения положительного результата после спондилодеза требуется бо­лее чем пятикратное увеличение содержания тромбоцитов в PRP по сравнению с исходным.

Подобные же противоречивые результаты получены и при сравнении данных о проли­ферации клеток сухожилия in vitro в клини­ческих условиях.

СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ ПЛАЗМЕ: «КЛИНИЧЕСКАЯ PRP»

За последние десять лет протоколы лечения PRP очень сильно усовершенствовались. Бла­годаря экспериментальным и клиническим исследованиям мы лучше поняли физио­логию тромбоцитов и других компонентов живой клетки. Более того, эффективность PRP-биотехнологий во многих областях ме­дицины, в том числе в дерматологии и пласти­ческой хирургии, подтверждена несколькими систематическими обзорами, метаанализами и рандомизированными контролируемыми испытаниями высокого уровня.

В настоящее время PRP характеризуется аб­солютной концентрацией тромбоцитов; это переход на новый уровень по сравнению с первоначальным определением PRP как плазмы, в которой концентрация тромбоци­тов просто выше исходного уровня. Теперь считается, что минимальная концентра­ция тромбоцитов должна составлять более 1 × 106 /мкл, что примерно в пять раз выше исходного значения. В подробном обзоре Fadadu и соавт. рассмотрено 33 системы и протокола, задействующих PRP. В некото­рых из этих систем готовые составы с PRP со­держали меньше тромбоцитов, чем цельная кровь. По данным исследователей, после од­нократного центрифугирования содержание тромбоцитов в PRP повысилось всего на 0,52. Система же с двойным центрифугированием позволила добиться наиболее высокой кон­центрации тромбоцитов (1,6 × 106 /мкл).

Очевидно, что исследования in vitro и на жи­вотных неидеальны для успешного переноса в клиническую практику. Пока не достиг­нут консенсус по стандартизации составов и приготовления PRP, следует придерживаться клинической формулы PRP, обеспечивающей достаточно высокий уровень восстановления тканей и улучшение клинических результатов.

КЛИНИЧЕСКАЯ ФОРМУЛА ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ ПЛАЗМЫ

В настоящее время эффективная клиниче­ская PRP (C-PRP) описана как сложный набор различных аутологичных клеток в неболь­шом объеме плазмы, получаемой из фрак­ции периферийной крови после центрифу­гирования. Поскольку фракции крови имеют разную клеточную плотность (тромбоци­ты — самую низкую), PRP и ее нетромбоци­тарные компоненты можно получить после центрифугирования из концентрирующего устройства, как показано на рис. 1.

Чтобы добиться хороших клинических ре­зультатов, C-PRP должна отвечать определенным требованиям (т. е. соответствие виду тканей, достаточная концентрация тромбо­цитов, минимальная примесь эритроцитов, добавление или устранение определенных типов лейкоцитов). Эти качества C-PRP в сочетании с выявлением действия разных тромбоцитарных факторов роста, белковых фракций, цитокинов и хемокинов позволяют лучше понимать фундаментальные механиз­мы восстановления тканей, включающие ми­тогенез, ангиогенез, хемотаксис и формиро­вание внеклеточного матрикса.

КОНЦЕНТРАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ

Чтобы оказывать лечебное действие, C-PRP должна содержать клиническую дозу скон­центрированных тромбоцитов. Они должны стимулировать пролиферацию клеток, син­тез мезенхимных и нейротропных факторов; способствовать хемотаксической миграции клеток, а также стимулировать иммуномоду­лирующие процессы, что показано на рис. 2.

Чтобы значительно усилить ангиогенную ре­акцию и стимулировать пролиферацию и ми­грацию клеток, C-PRP должна содержать не менее 7,5 × 109 тромбоцитов в 5 мл PRP-пре­парата.

1ав.jpg2ав.jpg

РИС. 1. Разделение по уровням клеточной плотности после двойного центрифугирования. После первого цен­трифугирования компоненты цельной крови распределяются по двум базовым уровням — плазменная суспензия (бедная тромбоцитами) и слой эритроцитов. По завершении второго этапа центрифугирования получается необходимый объем PRP для последующего использования у пациентов (А). Увеличенная часть рисунка (Б) показы­вает в области дна емкости структурированный многокомпонентный слой лейкоцитарной пленки (синие линии) с высоким содержанием тромбоцитов, моноцитов, лимфоцитов (по градиенту плотности). В данном случае, следуя протоколу изготовления бедной нейтрофилами C-PRP, можно получить препарат с минимальным содер­жанием нейтрофилов (менее 0,3%) и эритроцитов (менее 0,1%).

Помимо концентрации тромбоцитов, влия­ние PRP на активность клеток, по-видимому, зависит в значительной мере и от времени экспозиции. Soffer и соавт. обнаружили, что при кратковременном воздействии чело­веческого тромбоцитарного лизата усили­вается пролиферация костных клеток и хе­мотаксис. Длительное же воздействие PRP приводит к снижению активности щелочной фосфатазы и ослаблению формирования ми­нерального вещества. мотаксис. Длительное же воздействие PRP приводит к снижению активности щелочной фосфатазы и ослаблению формирования ми­нерального вещества.

3ав.jpg

РИС. 2. Активированные тромбоциты, высвобождающие факторы роста, и молекулы адгезии участвуют в самых разных клеточных взаимодействиях: это хемотаксис, адгезия, миграция, дифференциация клеток; также их наличие является условием иммуномодулирующей активности. Такие тромбоцитарно-клеточные взаимодей­ствия являются частью процессов ангиогенеза и воспаления, в конечном итоге стимулируя процессы восстанов­ления тканей. Сокращения: ВМА — аспират костного мозга; ЕРС — эндотелиальные клетки-предшественники; ЕС — клетки эндотелия; 5-НТ — серотонин; RANTES — (экспрессируемый и предположительно секретируемый нормальными Т-клетками при активации); JAM — узловые молекулы адгезии; CD40L — лиганд кластера дифферен­циации 40; SDF-1α — стромальный клеточный фактор 1 альфа; CXCL — хемокиновый лиганд (мотив С-Х-С); PF4 — тромбоцитарный фактор 4. Подготовлено на основе: Everts et al.

ВРЕДОНОСНЫЕ ЭРИТРОЦИТЫ

Обычно жизненный цикл эритроцита состав­ляет порядка 120 часов. Под воздействием посторонних сил (например, при заборе цель­ной крови, иммуновоспалительных процес­сах, оксидативном стрессе или несоблюдении надлежащих протоколов по концентрации PRP) возможно повреждение эритроцитов в образцах PRP. Вследствие этого разрушается клеточная мембрана эритроцитов и высво­бождается токсичный гемоглобин, опреде­ляемый в этом случае как неплазматический гемоглобин, гемин и железо.

Неплазматический гемоглобин и продукты его распада (гем и железо) оказывают небла­гоприятное, цитотоксическое действие на ткани, вызывая оксидативный стресс, поте­рю оксида азота, активацию воспалительных процессов и иммуносупрессию. Все это при­водит к нарушениям микроциркуляции, ло­кальному спазму сосудов и их повреждению, а также выраженному воспалению тканей. Важнее всего то, что, когда C-PRP с приме­сью эритроцитов поступает к тканям, она вызывает локальную реакцию под названием эриптоз, в результате которой высвобождает­ся мощный цитокин — фактор ингибирования миграции макрофагов. Этот цитокин замед­ляет миграцию моноцитов и макрофагов. Он формирует выраженные провоспалительные сигналы окружающим тканям, подавляющие миграцию стволовых клеток и пролиферацию фибробластов, а также вызывающие сильную локальную клеточную дисфункцию.

В свете вышесказанного важно ограничи­вать примесь эритроцитов в препаратах PRP. При правильно выполненном центрифуги­ровании и обработке C-PRP количество эри­троцитов обычно снижается, а то и сводится к нулю, что позволяет избежать нежелатель­ных последствий гемолиза и эриптоза.

ЛЕЙКОЦИТЫ В C-PRP

Присутствие в составе препаратов PRP лей­коцитов зависит от оборудования и прото­кола производства препаратов. В специали­зированных устройствах для приготовления изолированной плазмы лейкоциты устраня­ются полностью. Если PRP готовят из цель­ной крови, в лейкоцитарной пленке лейко­циты содержатся в высокой концентрации. Лейкоциты сильно влияют на биологию протекания острых и хронических заболева­ний тканей, поскольку обладают иммунным защитным действием. Следовательно, при­сутствие определенных лейкоцитов в C-PRP может оказывать значительное влияние на клетки и ткани. Точнее говоря, разные систе­мы послойного приготовления PRP исполь­зуют разные протоколы, поэтому и количе­ство нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов в PRP получается разным. Эозинофилы и ба­зофилы в препаратах PRP не обнаруживают­ся, так как их клеточная мембрана слишком хрупка и не выдерживает процесса центри­фугирования.

НЕЙТРОФИЛЫ

Нейтрофилы — наиболее многочисленный вид лейкоцитов, участвующий во многих процессах заживления: вместе с антибак­териальными белками, содержащимися в тромбоцитах, они формируют плотные барь-еры против патогенов.

Желательность присутствия нейтрофилов определяется целями лечения при помощи С-PRP. При биологических методах лечения с помощью PRP хронических ран, а также для усиления роста или заживления костей может потребоваться повышенный уровень провоспалительной активности в тканях. Важно, что в нескольких экспериментах были выявлены дополнительные функции нейтро­филов: они также участвуют в процессах ан­гиогенеза и репарации тканей.

Однако нейтрофилы могут оказывать и вредное действие, поэтому в ряде случаев их не следует применять. Zhou и Wang обна­ружили, что использование богатой нейтро­филами PRP может привести к увеличению количества коллагена III типа по сравнению с I типом, что усиливает фиброз и снижа­ет прочность сухожилий. Кроме того, при участии нейтрофилов может происходить высвобождение воспалительных цитокинов и матриксных металлопротеиназ, способ­ствующих провоспалительному и катаболи­ческому действию на ткани, в частности раз­рушению коллагеновых волокон.

МОНОЦИТЫ — МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ ВОССТАНАВЛИВАЮЩИЕ КЛЕТКИ

В зависимости от аппаратуры, используемой для подготовки PRP, моноциты могут быть обильно представлены в препаратах PRP или отсутствовать вовсе. К сожалению, их функции и регенеративные свойства редко обсуждаются в литературе, поэтому и в опи­сании методов изготовления или готовых со­ставов моноцитам уделяется мало внимания.

Гипотетически, когда C-PRP, содержащая большое количество моноцитов, вводится в поврежденный участок тканей, моноциты, скорее всего, дифференцируются в макро­фаги, что приводит к существенным измене­ниям в составе клеток.

При переходе моноцитов в макрофаги они приобретают определенный фенотип. Пер­вый фенотип характеризуется секрецией воспалительных цитокинов (IFN-γ) с выра­боткой оксида азота, в результате чего фор­мируется эффективный механизм уничто­жения патогена. При этом фенотипе также вырабатывается фактор роста эндотелия со­судов и фактор роста фибробластов.

Второй фенотип — противовоспалительные клетки с высокой способностью к фагоци­тозу. Макрофаг второго типа вырабатывает компоненты внеклеточного матрикса, ангио-генные и хемотаксические факторы, а так­же интерлейкин-10. Помимо защиты от па­тогенов, второй фенотип может облегчить воспалительную реакцию и способствовать восстановлению тканей.

Резонно предположить, что составы C-PRP с высокой концентрацией моноцитов и ма­крофагов, вероятно, лучше будут стимули­ровать регенерацию ткани, поскольку у них выше способности к устранению воспалений и передаче межклеточных сигналов.

СТАРЕНИЕ КЛЕТОК И ВОЗМОЖНОСТИ ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ ПЛАЗМЫ

Было признано, что старение тем сильнее влияет на эффективность стволовых клеток, чем их становится меньше. В человеческом организме с возрастом также ослабевают такие характеристики стволовых клеток, как собственно «стволовость», пролиферация и дифференциация.

Wang и Nirmala пишут, что старение ослаб- ляет свойства теноцитных стволовых клеток и уменьшает количество рецепторов к фак­торам роста. Исследование на лошадях по­казало, что концентрация тромбоцитарных факторов роста выше у молодых животных. Исследователи заключили, что повышенное число рецепторов к факторам роста и их большее количество у молодых может быть причиной лучшей реакции клеток на лече­ние с помощью PRP, чем у более пожилых особей. Эти данные позволяют объяснить снижение (или даже полное отсутствие) эф­фекта лечения при помощи PRP у пожилых людей: их стволовые клетки малочисленны и «хуже качеством».

Было показано, что после инъекций PRP про­цесс старения хрящевой ткани можно повер­нуть вспять, при этом повышая стабильность хондроцитов. Jia и соавт. провели исследо­вание фотостарения кожных фибробластов у мышей in vitro с использованием PRP и без нее, чтобы лучше понять нейтрализующее действие тромбоцитарных факторов роста в этих условиях. В группе PRP обнаружилось непосредственное воздействие на внекле­точный матрикс, повышенный синтез колла­гена I типа и пониженный — металлопротеи­назы. Это позволило предположить, что PRP способна компенсировать старение клеток.

В другом исследовании PRP применили к ста­реющим стволовым клеткам костного мозга, полученным у старых мышей. Было определе­но, что PRP может восстанавливать ряд функ­ций стволовых клеток вопреки возрастным изменениям — например, их способность к пролиферации и образованию колоний, при этом нивелируя маркеры старения.

Oberlohr с коллегами подробно изучили роль старения клеток в замедлении мышечной регенерации, оценив возможности PRP как биологического инструмента стимуляции восстановления скелетных мышц. Исследо­ватели предполагали, что применение PRP для восстановления скелетных мышц будет основано на модификации биологических факторов путем направленного воздействия на специфические клеточные маркеры SASP (секреторный фенотип, связанный с хрониче­ским старением) и прочие факторы, способ­ствующие проявлению фиброза.

Логично предположить, что целенаправ­ленная борьба со старением клеток может улучшить восстанавливающие свойства биологического лечения с помощью PRP за счет сокращения количества локальных фак­торов SASP. Находки относительно действия PRP на старение клеток впечатляют, но это лишь начало, поэтому на данный момент ни­каких рекомендаций давать не возьмемся.

ПЕРСПЕКТИВЫ И ВЫВОДЫ

Технологические достижения в области раз­работок аппаратуры для производства PRP и методов приготовления препарата позволи­ли получить многообещающие клинические результаты, хотя окончательной ясности относительно связи разных составов PRP и биологических свойств готовых продуктов пока не достигнуто. Более того, и весь спектр применения PRP еще предстоит оценить. До недавнего времени PRP существовала на рынке как аутологичный продукт крови, дающий врачам возможность применять аутологичные тромбоцитарные факторы ро­ста для лечения определенных патологий и нарушений. Изначально часто упоминаемый единственный критерий успешного приме­нения PRP — концентрация тромбоцитов в готовом препарате выше, чем в цельной кро­ви. К счастью, сегодня специалисты лучше понимают, как действует PRP.

Однако стандартизация и классификация методов изготовления препарата PRP пока далеки от идеала. Соответственно, нет пока и консенсуса относительно биологического состава PRP, хотя большинство публикаций сходится во мнении о эффективной кон­центрации тромбоцитов, необходимой для поддержания процесса (нео)ангиогенеза. Важным фактором благоприятного или не­благоприятного действия PRP также служит присутствие в ее составе лейкоцитов.

Чтобы определить весь потенциал и, следо­вательно, терапевтическое действие PRP в разных клинических ситуациях, потребуются достаточно обстоятельные и детально доку­ментированные клинические исследования.